ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ , основаны на взаимодействии антигена и находящегося в иммунной сыворотке антитела (согласно представлениям Эрлиха) или антигена и специфически измененной под влиянием иммунизаторного раздражения сыворотки (согласно новейшим воззрениям). Важнейшие И. реакции-аглютинация, преципитация, бактериолиз, реакция отклонения комплемента, реакция, основанная на действии опсонинов. Аглютинация и преципитация происходят при встрече антигена и соответствующего антитела; для осуществления бактериолиза, реакции отклонения комплемента и др. требуется помимо антигена и антитела также участие комплемента. Значение И. реакций двоякое. С их помощью можно ставить диагноз той или иной заразной болезни, приводя в соприкосновение сыворотку больного с микробом, возбудителем предполагаемой инфекции (реакция Видаля при брюшном тифе и парати-фах, реакция отклонения комплемента при различных инфекциях). С другой стороны, имея сыворотку, иммунную к определенной инфекции, возможно идентифицировать микроб, природа к-рого неизвестна. Преципитация имеет значение также в сан.-гиг. и суд.-мед. практике, позволяя определять видовую принадлежность животного, к которому относится исследуемый материал.

Иммунологические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций. Их применяют:
1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. в серологической диагностике инфекционного заболевания;
2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации его.

ИР выявляют образование комплекса АГ-АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГАТ, утративший растворимость а изотонических растворах. Вторая стадия - неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в которой происходит взаимодействие АГ и АТ.

При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглюти-ната, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые (мелкодисперсные) АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках угля и др.)

Скорость реакции зависит от:
- оптимального соотношения АГ и АТ;
- степени специфичности АГ и АТ; -рН среды (7,2-7,4);
- концентрации электролитов (0.85 % натрия хлорида).

В зависимости от состояния АГ, АТ и особенностей среды, в которой взаимодействуют АГ и АТ, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, комплемента, нейтрализации и др.

ИР подразделяются на простые (двухкомпонентные, участвуют только АГ, АТ) и сложные (трехкомлонентные и многокомпонентные, участвуют АГ, АТ и реагирующая система - сенсибилизированные эритроциты, культура клеток, кожа восприимчивого животного и др.).

Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

1. Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

Рис. 2. РА на стекле.

На предметное стекло наносят каплями:

1 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;
3 -ья капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий . Перемешивают.

Примечание : положительный результат - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа.

2. Учет результатов РНГА , поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками . Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Рис. 3. Постановка и результат РНГА.

Учет зонтик пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

Реакция преципитации – это формированиеи осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

3. Постановка и учет реакции кольцепреципитации для определения видовой принадлежности кровяного пятна.

Постановка . В узкую пробирку №1 диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой против белков крови человека в количестве 0,3-0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена (экстракт кровяного пятна ). В пробирку №2 приливают преципитационную сыворотку против белков барана, в пробирку №3 - физиологический раствор (контроль) и добавляют также, как в первую пробирку антиген. Пробирки осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.
Учет . Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через 20-24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

Рис. 4. Реакция кольцепреципитации.

4. Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции преципитации в агаре .

Эта издавна используемая реакция преципитации, предложенная для определения токсичности коринебактерий дифтерии, ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри. Вдоль ее посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой . После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры. В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная, должна быть заведомо токсигенной. Посевы помещают в термостат.

Учет реакций проводят через 24-48-72 ч. Если культура токсигенная, на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата, совпадающие с линиями преципитата контрольной культуры. Они имеют вид «стрел-усиков », которые хорошо видны в проходящем свете.

Рис. 5. Реакция преципитации в агаре.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

5. Постановка непрямой реакции гемагглютинации (РНГА ) выявления титра специфических антител у больного.

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика).
Постановка . В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.
Учет . В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик ), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Рис. 6. Результат РНГА. Титр антител - 1:100.

6. Постановка развернутой реакции агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр ). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий, с которыми безопасно работать.
Ставят реакцию следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками:++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).
За титр сыворотки принимают последнее ее разведение , в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

Рис. 7. Развернутая реакция агглютинации.

В XVIII в. многие люди, будучи уверены, что когда-нибудь в жизни они все равно зара-зятся оспой, намеренно подвергали себя возможности заражения, для того чтобы переболеть этой болезнью в более благоприятных условиях и в дальнейшем не опасаться ее. Даже и теперь некоторые родители из тех же соображений не предохраняют своих детей от заражения детскими болезнями, зная, что некоторыми болезнями люди болеют лишь один раз в жизни. Этот тип устойчивости называется приобретенным иммунитетом. Но человек, невосприимчивый к оспе в результате перенесения этой болезни, обладает такой же восприимчивостью к кори или к любой другой болезни, как и тот, кто никогда не болел оспой; поэтому мы говорим, что иммунитет специфичен.

Активно приобретенный иммунитет обусловлен образованием в организме специфических белков, так называемых антител, которые выделяются в кровь и в тканевые жидкости после проникновения в организм какого-либо чужеродного белка, называемого антигеном. Антиген и антитело реагируют друг с другом, и это предохраняет организм от повреждения. Если, например, впрыснуть кролику яичный альбумин (белковое вещество), то клетки животного отвечают выработкой антител, специфичных по отношению к этому альбумину. Кроме того, организм способен вырабатывать особый род антител, называемый антитоксином, в ответ на присутствие токсина (обычно белка), выделяемого бактерией. После того как образовалось достаточное количество антитоксина, данный токсин уже не может причинить вреда организму.

Уже несколько десятков лет назад было известно, что антитела, образующиеся в ответ на введение данного антигена, не всегда однородны - они могут различаться по своей специфичности, по степени активности в отношении реакции с антигеном и по физико-химическим свойствам, (величине и форме молекулы, ее суммарному заряду и последовательности аминокислот).

Антитела, циркулирующие в крови, связаны с определенной фракцией плазмы - гамма-глобулинами. Гамма-глобулины - белки, очень сходные по своим физическим и химическим свойствам, но различающиеся по специфичности в отношении антигенов. Различия между разными антителами совершенно неуловимы; они даже еще более тонкие, чем различия между разными ферментами. По-видимому, лишь небольшая часть белковой молекулы (имеющая молекулярный вес порядка 160 000) иммуноло-гически активна. Различия между разными

антителами, по-видимому, сводятся к незначительным различиям в форме молекулы бедка, в расположении составляющих ее атомов, обеспечивающем комплементарность геометрических конфигураций антигена и антитела, которые должны подходить друг к другу, как ключ и замок.

Лимфатические ткани обычно синтезируют антитела только к «чужеродным» белкам, т. е. к белкам, которые при нормальных условиях не содержатся в организме. Но иногда некоторые нормальные компоненты тела могут обладать антигенным действием и вызывать обра-

зование антител; в результате возникающей при этом реакции антиген-антитело человек может заболеть.

После инъекции антигена наступает латентный период, продолжающийся примерно неделю, а затем в крови появляются антитела. Титр антител медленно повышается, достигает невысокого пика (первичная реакция) и вновь снижается. Вторичная инъекция антигена через несколько дней, недель или даже месяцев вызывает быстрое образование антител после более короткого латентного периода (вторичная реакция). Титр антител достигает более высокого уровня и снижается медленнее. Последующие инъекции антигена вызывают дополнительные вторичные реакции, до тех пор пока не будет достигнут максимальный титр. Со временем этот титр обычно снижается, и периодическая peiиммунизация помогает поддерживать иммунитет на удовлетворительном уровне. У предварительно иммунизированного человека вторичную реакцию можно также вызвать, заразив его естественным инфекционным агентом; антитела при этом обычно образуются достаточно быстро и предотвращают появление симптомов заболевания.

Механизм образования специфических антител под действием антигена неизвестен. Известно только, что антитела синтезируются заново из аминокислот, а не просто образуются путем изменения пространственной конформа-ции предсуществующей полипептидной цепи. Синтез этих специфических белков происходит, вероятно, так же, как и обычный синтез белков в рибосомах клетки, т. е. под контролем рибонуклеиновокислотных матриц (см. разд. 342). Антиген, по-видимому, входит в плаз-моциты и другие «иммунологически компетент-ные» клетки и вызывает образование специфической нуклеиновой кислоты-матрицы, которая в свою очередь определяет образование специфического антитела. Возможно, что информацию, необходимую для синтеза специфических антител, доставляет сам антиген или же она постоянно присутствует в клетке, будучи заключена в генах, но может быть использована только в присутствии специфического антигена. Высказывалось также мнение, что проникновение в клетку антигена ведет к проявлению генетически обусловленной способности к синтезу специфического антитела, находившейся до того в скрытом состоянии. Эта последняя теория дает наилучшее объяснение экспериментальным фактам, известным в настоящее время, и больше соответствует общей теории регуляции синтеза белков. Когда плаз-моциты, образующие специфическое антитело, делятся, обе дочерние клетки сохраняют способность вырабатывать такие же антитела, и эта информация передается на протяжении многих поколений клеток.

Антитела реагируют с антигеном одним или несколькими различными способами. Они могут соединяться с токсином, нейтрализуя его ядовитые свойства; они могут растворять клетки бактерий; наконец, они могут сенсибилизировать бактерии - делать их более уязвимыми для лейкоцитов. Некоторые антитела агглютинируют микробы тем самым препятствуя их распространению и еще вернее обеспечивая их задержку в лимфатических узлах.

Антитела метят, присоединяя к ним флуоресцирующий краситель, после чего их можно выявлять в специфических участках тканей с помощью микроскопа. Этот метод, разработанный в 1941 г. Кунсом, позволил проводить разнообразные исследования с определением локализации в клетке специфических реакций между антигеном и антителом; он используется также в диагностике инфекционных болезней.

Другой способ приобретения иммунитета состоит в прививке при помощи вакцины. Вакцина - это специально производимый в больших количествах антиген, характерный для определенной болезни, достаточно сильный, чтобы стимулировать образование антител в организме, но не настолько сильный, чтобы вызвать самую болезнь. Токсичность антигена понижают различными способами. Некоторые вакцины содержат лишь небольшое количество токсина. Другие представляют собой комбинацию токсина с антитоксином: в то время как

антиген заставляет организм вырабатывать больше антител, антитела самой вакцины защищают клетки от повреждения. Некоторые токсины подвергают тепловой или химической обработке, уничтожающей их вредные свойства, но сохраняющей их способность стимулировать образование антител; такого рода вакцина называется анатоксином. Еще один метод состоит в ослаблении культур бактерий путем длительного выращивания их в пробирках, где они в конце концов утрачивают часть своей токсичности. Антирабическую вакцину (вакцина против бешенства) ослабляют высушиванием, другие вакцины - последовательной прививкой их ряду лабораторных животных. Брюшнотифозную вакцину можно приготовить из убитых бактерий брюшного тифа.

Метод вакцинации был открыт в конце XVIII в. английским врачом Э. Дженнером, который заметил, что работники, имевшие дело с коровами, больными коровьей оспой, никогда не заболевали настоящей оспой. Когда он попробовал втереть немного жидкости, взятой из оспенных пузырьков на коровьем вымени, в царапину на коже человека, то возникло легкое заболевание с появлением одной локализованной оспины в месте втирания. Вакцинированные таким способом люди никогда не заболевали оспой. Коровью оспу и настоящую оспу вызывают два различных, но близкородственных вируса; прививка вируса коровьей оспы вызывает образование антител, способных реагировать также и с близкородственным ему вирусом оспы человека. Теоретически представляется возможным создавать путем прививок иммунитет против всех болезней, но для многих важных заболеваний, в том числе для туберкулеза, гриппа и сифилиса, способы вакцинации еще не разработаны.

Часто случается, что организм не способен достаточно быстро вырабатывать антитела для борьбы с антигенами микроба. В таких случаях производят инъекции антител какого-нибудь животного (обычно лошади), чтобы снабдить ими организм до того времени, когда он сам сможет вырабатывать их в достаточном для защиты количестве. Впрыскивание препарата антител (называемого сывороткой)- это единственный способ получения пассивного иммунитета; хотя такой иммунитет оказывает немедленное действие, он полностью исчезает спустя несколько недель.

Для приготовления сыворотки бактерий выращивают в пробирках до тех пор, пока не образуется большое количество токсина. Затем

этот токсин впрыскивают в возрастающих дозах лошади, и организм животного постепенно вырабатывает огромное количество антитоксина, который накапливается в крови. После этого у лошади время от времени берут кровь, удаляют из нее эритроциты и концентрируют антитоксин.

Естественный иммунитет. У всех животных и растений невосприимчивость к определенным болезням является наследственным свойством, и ее не приходится приобретать. Есть данные, указывающие на то, что различные расы человека наследственно различаются между собой по устойчивости к таким болезням, как туберкулез, дифтерия и грипп. Наследственная невосприимчивость к болезням, называемая естественным иммунитетом, передается из поколения в поколение.

Один из типов естественного иммунитета - это невосприимчивость, выработавшаяся в популяции, которая соприкасалась с возбудителем определенной болезни на протяжении многих поколений. Многие болезни (например, корь), в наши дни сравнительно легко протекающие

у европейцев, чрезвычайно тяжело протекали у американских индейцев и у жителей островов южной части Тихого океана, когда они впервые распространились среди этих народов. Сифилис тоже в настоящее время представляет собой гораздо более легкое заболевание, чем во времена первого появления его в Европе, когда он нередко в первый же месяц приводил к смерти. Многие тропические болезни, например малярия и сонная болезнь, у иностранцев протекают тяжелее, чем у местного населения. Другие болезни, первоначально весьма распространенные, со временем стали редкими: например, проказа чрезвычайно часто встречалась в библейские времена.

Эти изменения к лучшему обычно истолковывают как результат постепенного «естественного отбора»: люди, перенесшие в далекие времена данную болезнь, передавали свою «стойкость» своим потомкам и так далее. Возможно также, что в некоторых случаях адаптировались и сами микроорганизмы, что сопровождалось понижением их вирулентности.

Нормальный вирус или вирус, убитый слабым нагреванием или действием ультрафиолетового света, может препятствовать росту других вирусов в организме хозяина. Этим можно было бы объяснить малое распространение таких заболеваний, как полиомиелит, в областях, где эндемичны другие кишечные вирусы. Присутствие этих вирусов препятствует росту вируса полиомиелита; однако их действие состоит не в том, что они вызывают образование антител, а в том, что они побуждают клетки хозяина вырабатывать вещество, называемое интерфероном. Это вещество удалось выделить; оно представляет собой белок с молекулярным весом около 63 000.

Это недавно открытое явление служит, возможно, другим важным фактором защиты организма от болезней. Антитела имеют особенно важное значение в создании иммунитета к повторному заражению данным возбудителем; интерферон же, вероятно, играет важную роль в защите при первом заражении вирусом.

Исследователи доказали, что интерферон образуется в ответ на вирусную инфекцию; концентрация его достигает максимума на 3- 5-й день после заражения, тогда как антитела к инфекционному агенту появляются гораздо позднее - не ранее 8-го дня.

Интерферон действует не прямо на вирус, а на клетку-хозяина. Вирус проникает в клетки, обработанные интерфероном, но не способен размножаться в них. Интерферон, по-видимому, уменьшает количество АТФ, которое может быть использовано для размножения вируса, возможно путем разобщения процессов фосфо-рилирования и окисления (см. разд. 57). Имеющиеся данные позволяют предполагать, что существует интерферон только одного типа и что он эффективен против самых различных вирусов. Ссылки по теме

7. Эндоцитозные, сигнальные и растворимые рецепторы врожденного иммунитета.

8. Секреторные рецепторы врожденного иммунитета.

9. Система комплемента

10. Роль белков теплового шока и острой фазы.

11. Характеристика антимикробных пептидов и их продуцентов.

12. Интерфероны, природа. Способы получения и применения.

13. Роль и. И. Мечникова в формировании учения об иммуните­те. Неспецифические факторы защиты организма.

14. Клеточные факторы врожденного иммунитета (макрофаги, нейтрофилы, естесственные киллеры, дендритные клетки, тучные клетки, базофилы, nk и др.).

15. Фагоцитоз (стадии фагоцитоза, кислородный взрыв и др.)

16. Функции естественных киллеров.

17. Мембранные и цитозольные рецепторы врожденного иммунитета (tlr, nlr, rig). См. Ответ 7.

18. Классификация и характеристика дендритных клеток.

21. Антигены микробов и клеток человека (cd, mhc). Гаптены

22. Характеристика Th1, Th2, Th17 и Treg-лимфоцитов.

23. Иммунокомпетентные клетки; t- и в-лимфоциты, антигенпрезентирующие клетки.

25. Презентация антигена. Кооперация, основные принципы дифференцировки т- и в-лимфоцитов.

26. Формы иммуного ответа. Регуляция иммунного ответа.

27)Теории иммунитета. Генетика формирования т и в-клеточных рецепторов.

28) Иммунологическая толерантность,механизмы

29)Клеточный иммунный ответ (цитотоксический и воспалительный иммунный ответ, роль цитокинов, т-хелперов и макрофагов)

30)Гуморальный иммунный ответ (роль цитокинов, Th-2лимфоцитов и в-лимфоцитов).

31) Антитела. Классы, структура и функции иммуноглобулинов.

32) Антигенные свойства иммуноглобулинов, изотипы, аллотипы, идиотипы. Полные и неполные антитела.

33) Моноклональные антитела.Получение(гибридомная технология) и применение.

34) Генетика антителообразования.

35) Иммунологическая память. Первичный и вторичный ответ.

36) Мех-мы противоинфекционного (противобактериального и противовирусного) иммунитета

37) Мех-мы противогельминтного, противоопухолевого и трансплантационного иммунитета.

38)Гиперчувствительность немедленного типа. Мех-мы возникновения,клиническая значимость.

39) Анафилактический шок и сывороточная болезнь. Причины возникновения.Механизм.Их предупреждение.Аллергоспецифическая иммунотерапия.

40. Механизм гиперчувствительности замедленного типа. Клинико-диагностическое значение

44. Оценка иммунного статуса: основные показатели и методы их определения.

45. Механизмы развития аутоиммуных реакций.

46. Практическое использование серологических реакций.

47. Иммунологические реакции в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний.

50. Реакция пассивной гемагглютинации. Компоненты. Применение.

51. Реакция коагглютинации. Механизм, компоненты. Применение.

53. Реакция преципитации

54. Реакции с использованием меченых антител или антигенов

55. Реакция связывания комплемента

56. Реакция нейтрализации

57. Реакция иммунофлюоресценции (риф,методКунса)

58. Иммуноферментный метод или анализ

59. Иммунная электронная микроскопия

60. Проточная цитометрия

61. Серологические реакции, используемые для диагнос­тики вирусных инфекций.

62. Диагностикумы. Получение, применение.

63. Моноклональные антитела. Получение, применение.

64 Методы приготовления и применения агглютинирую­щих, адсорбированных сывороток.

65 Вакцины

4.2.5.1. Иммунные сыворотки и иммуноглобулины

46. Практическое использование серологических реакций.

Иммунные реакции используют при диа­гностических и иммунологических исследо­ваниях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помо­щью реакций антиген-антитело, определяе­мых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови боль­ного антител против антигенов возбудите­ля позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микро­бов, различных биологически активных ве­ществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепто­ров клеток и др.

При выделении микроба от больного про­водят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические ан­титела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы).

Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммуните­та характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Особенности взаимодействия антитела с ан­тигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro меж­ду антигеном и антителом состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

47. Иммунологические реакции в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний.

Иммунологические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций. Их применяют:

1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. в серологической диагностике инфекционного заболевания;

2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации его.

ИР выявляют образование комплекса АГ-АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГАТ, утративший растворимость а изотонических растворах. Вторая стадия - неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в которой происходит взаимодействие АГ и АТ.

При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглюти-ната, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые (мелкодисперсные) АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках угля и др.)

Скорость реакции зависит от:

Оптимального соотношения АГ и АТ;

Степени специфичности АГ и АТ; -рН среды (7,2-7,4);

Концентрации электролитов (0.85 % натрия хлорида).

В зависимости от состояния АГ, АТ и особенностей среды, в которой взаимодействуют АГ и АТ, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, комплемента, нейтрализации и др.

ИР подразделяются на простые (двухкомпонентные, участвуют только АГ, АТ) и сложные (трехкомлонентные и многокомпонентные, участвуют АГ, АТ и реагирующая система - сенсибилизированные эритроциты, культура клеток, кожа восприимчивого животного и др.).

В настоящее время широкое применение получили ИР, в которых участвуют меченые АГ и АТ (р. иммунофлюорес-ценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы).

48. Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение .

Реакция агглютинации - простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра - рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя, выделенного от больного;

3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.

49. Реакция Кумбса - антиглобулиновый тест для определения неполных антиэритроцитарных антител. Тест Кумбса используется для выявления антител к резус-фактору у беременных женщин и определения гемолитической анемии у новорождённых детей с резус-несовместимостью, влекущей разрушение эритроцитов.

Суть данного метода заключается в том, что антиглобулиновая сыворотка, содержащая антитела к иммуноглобулинам человека, при реакции с эритроцитами, сенсибилизированными неполными антителами, приводит к их агглютинации.

В зависимости от того, фиксированы ли антитела на поверхности эритроцитов или находятся в свободном состоянии в плазме крови, применяется прямая или непрямая проба Кумбса.

Прямая проба Кумбса ставится в тех случаях, когда есть основания предполагать, что исследуемые красные кровяные клетки уже in vivo подверглись сенсибилизации соответствующими антителами, т.е. первая фаза реакции - фиксация антител на поверхности эритроцитов - произошла в организме и последующее добавление антиглобулиновой сыворотки вызывает агглютинацию сенсибилизированных клеток.

С помощью непрямой пробы Кумбса выявляют неполные антитела, присутствующие в исследуемой сыворотке. В данном случае реакция протекает в два этапа. Первый этап - инкубация тест-эритроцитов с исследуемой сывороткой, во время которой происходит фиксация на эритроцитарной поверхности антител, содержащихся в исследуемом образце сыворотки. Второй этап - добавление антиглобулиновой сыворотки.

Реакция Кумбса прямая (прямой антиглобулиновый тест)

Материал для исследования: кровь из локтевой вены.

Взрослым – 3 мл крови;

Детям – 1-2 мл крови.

В норме реакция Кумбса отрицательна

Метод исследования: гельфильтрации

Прямая проба Кумбса применяется для выявления антител или компонентов комплемента, фиксированных на поверхности эритроцитов. Если на поверхности эритроцитов фиксированы антитела или компоненты комплемента, добавление антиглобулиновой или антикомплементарной сыворотки вызывает агглютинацию эритроцитов.

Положительная прямая реакция Кумбса подразумевает, что in vivo эритроциты покрыты иммуноглобулинами или комплементом. Полиспецифические и анти-IgG реагенты позволяют выявить примерно 500 молекул IgG на эритроците, но имеются сведения, что при аутоиммунной гемолитической анемии эритроциты покрыты меньшим количеством иммуноглобулинов.

Положительно при :

аутоиммунном гемолизе;

гемолитической болезни новорожденных;

лекарственной иммунной гемолитической анемии;

гемолитических трансфузионных реакциях.

Реакция Кумбса непрямая

Материал для исследования - кровь из локтевой вены. сывовротка должна быть быстро отделена от крови.

Взрослым – 3 мл крови;

Детям – 1-2 мл крови.

В норме: отрицательно.

Метод: гельфильтрации

Непрямая реакция Кумбса позволяет обнаружить антитела к эритроцитам в сыворотке. Демонстрирует присутствие в плазме пациента неожидаемых антител к АВО- и резуссовместимым эритроцитам. Агглютинация показывает, что сыворотка содержит антитела к антигенам, имеющимся на поверхности реагентных эритроцитов.

Непрямую реакцию применяют в следующих случаях:

для определения индивидуальной совместимости крови донора и реципиента;

для выявления аллоантител, включая антитела, вызывающие гемолитические трансфузионные реакции;

для определения поверхностных эритроцитарных антигенов в медицинской генетике и судебной медицине;

для подтверждения однояйцовости близнецов при трансплантации костного мозга.

Положительно при:

присутствии аллоантител;

присутствии аутоантител.

Взаимодействие in vitro между специфическими антигенами и антителами называют иммунологической реакцией, которая состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab -фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

В микробиологии и иммунологии применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия специфических антигенов с антител и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Иммунологические реакции характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Серологический метод.

От латинского serum ¾ сыворотка: серология ¾ раздел иммунологии, изучающий закономерности взаимодействия АГ и AT сыворотки крови. Соответственно реакции АГ+АТ, происходящие in vitro, называются серологическими реакциями. Серология имеет огромное прикладное и практическое значение в современной клинической лабораторной диагностике инфекционных, аутоиммунных, эндокринных и других заболеваний.

Серологический метод исследования (диагностики) ¾ это метод, основанный на изучении сыворотки больного с целью определения в ней антител. В настоящее время понятие серологического метода расширено, так как разработаны высокочувствительные серологические реакции, предполагающие обнаружение AT не только в сыворотке крови больных, но и в других биологических жидкостях: слюне, ликворе, биосекретах).

Основные характеристики:

1) взаимодействие АГ и AT строго специфично;

2) серологическая реакция проходит при эквивалентных (соответствующих друг другу) соотношениях количества АГ и AT;

3) серологическая реакция имеет двухфазный характер:

· специфическое взаимодействие ¾ фаза невидимая;

· образование видимых комплексов ¾– для этого добавляют физиологический раствор;

4) серологическая реакция проходит по типу физико-химической реакции в коллоидной системе;

5) выделяется небольшое количество тепла.

Цели применения серологических реакций:

1) серологическая идентификация - это определение вида неизвестного АГ при помощи известных AT (иммунной диагностической сыворотки). В этом случае:

а) неизвестные АГ ¾ это микроорганизмы патогенные и непатогенные, токсины разного происхождения, белки крови, клетки разных органов и ткани другого вида или группы, клетки трансплантанта;

б) известные AT ¾ это стандартные препараты ¾ иммунные диагностические сыворотки (ИДС) специфичные определённому (искомому) АГ

2) серологическая диагностика (метод) ¾ это определение неизвестных AT в сыворотке крови или других биологических жидкостях больного с помощью известного АГ (диагностикума).

а) неизвестные AT ¾ это искомые AT сыворотки крови людей ¾ больных, переболевших, носителей, вакцинированных;

б) диагностикумы ¾ это стандартные препараты, которые получают из чистых культур микроорганизмов определенных видов или их АГ. Микроорганизмы выращивают, затем инактивируют, стандартизируют (количество микробов в единице объема); инактивацию проводят: нагреванием, формалином, спиртом и т.д. (диагностикум теряет патогенность, но сохраняет антигенные свойства).

Основные понятия серологии Диагностикум ¾взвесь убитых микробов. Титр антител ¾наибольшее разведение исследуемой сыворотки, при котором произошла положительная реакция (агглютинации, связывания комплемента и т.п.). Диагностический титр ¾наименьший титр специфических антител у больного данной инфекцией человека, с которого реакция может считаться специфической (положительной). Парные сыворотки ¾двесыворотки одного пациента, первая из которых берется на 5-8 день заболевания, вторая ¾ через 10-14 дней, с целью оценить динамику иммунного ответа. Феномен нарастания титра антител ¾увеличение концентрации специфических антител в исследуемых парных сыворотках в 4 и более раз, свидетельствующее о наличие данного заболевания у человека в данный момент.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (РА) (лат. agglutinatio ¾ склеивание) реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных (нерастворимых) антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра). РА используют для: определения антител в сыворотке крови больных (например, при бруцеллезе ¾ реакции Райта, Хеддельсона, при брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекциях), идентификации возбудителя, выделенного от больного;

Для определения у больного антител ставятразвернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум и через 2 часа инкубации при 37 °С и 18-20 часов при комнатной температуре отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и Н-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении с физиологическим раствором 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка истепени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без комков.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким способом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предло­жено А. Кастелляни (1902).

Реакция коагглютинации. Клетки возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

В последние годы ассортимент диагностикумов из убитых микробов дополнили так называемые суспензионные Аг и AT, сорбированные на различных инертных корпускулярных носителях. Среди них наибольшее распространение нашёл метод латекс-агглютинации , основанный на взаимодействии Аг (или AT) в образце с частицами латекса, нагруженными специфическими моноклональными AT (или Аг), что ведёт к быстрому образованию видимых агрегатов.