Применение иммунологических реакций в медицинской практике. Иммунология

Иммунологические реакции можно классифицировать на четыре типа, исходя из видов участвующих в них антител и модулирующих реакцию клеток, характера антигенов и длительности реакции. Иммунная реакция является очень сложной, с внутрисистемными ауторегуляторными связями на разных уровнях, хотя отдельные реакции обычно классифицируются как функционально разобщенные. Так, одно и то же лекарственное средство (например, пенициллин) у разных больных может вызвать иммунологические реакции как первого, так и второго или третьего типа. Некоторые чрезмерной силы ответные реакции были отнесены к реакциям гиперчувствительности потому, что они приводили к разрушению или повреждению тканей хозяина . Несмотря на это, классификация Gell и Coombs продолжает служить основой для понимания патологической физиологии и того спектра иммунологических реакций, которые практический врач видит в клинике . В табл. 2 приведена характеристика четырех типов иммунологических реакций.
Тип I. Примером реакции первого типа являются анафилактические реакции, которые называются также реакциями гиперчувствительности немедленного типа. Реакция вызывается антителом типа IgE, прикрепляющимся к поверхности тучных клеток и базофильных нейтрофи-

Таблица 2. Классификация иммунологических реакций и Coombis (1975)

Цитотоксическая
реакция
Иммунный комплекс
Г иперчувствитель- ность замедленного типа, клеточноопосредованный иммунитет
Реакция антиген - IgE происходит на поверхности тучных клеток и базофилов с высвобождением медиаторов
Реакция IgG, IgM с антигеном происходит на клеточных мембранах, активируется комплемент, высвобождаются анафилатоксины, разрушаются клетки
IgE и IgM реагируют с антигеном независимо от фиксации и откладываются в микрососудах, комплемент активируется, клетки разрушаются
Не участвуют Специализированные Т-лимфоциты реагируют с антигенами, высвобождаются лимфокины
Анафилаксия Волдыри и эритема на коже
Экзогенная астма
Трансфузионные реакции
Г емолитическая анемия
Резус-конфликт
Сывороточная болезнь Г ломерулонефрит
Контактный дерматит Туберкулиновая реакция

лов; Если к такому прикрепленному антителу IgE присоединится антиген, то активация и дегрануляция клетки приведут к высвобождению различных фармакологически активных веществ, вызывающих классическую анафи- лаксию\ (гл. 2). Однако не все аллергические реакции первого типа являются анафилактическими. К первому типу относятся классическая картина аллергии на введение пенициллина, реакции на пчелиный яд, экзогенно-аллергическая астма и аллергический ринит. Вообще к первому типу относятся все аллергические реакции .
Тип II. Реакции второго типа известны как цитоток- сические реакции. В них участвуют антитела типа IgG или IgM, называемые цитотоксическими антителами. Реакции этого типа возникают тогда, когда антитела соединяются с иммуноспецифическими антигенами. В роли антигенов могут выступать сложные компоненты клеточных мембран (антигены групп крови) или молекулярные компоненты, известные как гаптены, адгезирующие- ся к поверхности эритроцитов (например, пенициллин). Взаимодействие антигена с антителом активирует систему комплемента, которая в свою очередь лизирует клетки. Во время активации комплемента высвобождаются фрагменты пептидов - анафилатоксины, которые вызывают системные реакции. К реакциям второго типа относятся, например, посттрансфузионные реакции на основе несовместимости крови по системе АВО, гемолитическая болезнь новорожденных, аутоиммунные и гемолитические анемии, а также синдром Гудпасчера.
Тип III. Реакции третьего типа известны как реакции иммунных комплексов. Антитела и циркулирующие растворимые антигены образуют нерастворимые комплексы, слишком маленькие для того, чтобы удаляться макрофагами ретикулоэндотелиальной системы печени и селезенки. Вместо этого комплексы откладываются в микроцир- куляторном русле. В реакции участвуют антитела класса IgG или IgM. Взаимодействие антигена с антителами активирует комплемент, вследствие чего возникает воспалительный процесс, локализующийся вокруг отложенных комплексов. Освобожденные анафилатоксины вызывают также миграцию других воспалительных клеток и возникновение васкулита. Механизм повреждения ткани состоит в опосредованном комплементом привлечении к месту фиксации иммунных комплексов полиморфноядерных лейкоцитов. Классическим примером аллерги
ческой реакции III типа является так называемая сывороточная болезнь, возникающая после повторного введения чужеродных иммунных сывороток при змёиных укусах и ботулизме или антилимфоцитарного глобулина. Примерами реакций третьего типа являются такжеваску- литы, возникающие после введения пенициллина, и лекарственная системная красная волчанка.
Тип IV. Реакции четвертого типа известны как клеточно-опосредованные иммунные реакции или реакции гиперчувствительности замедленного типа. Эти реакции не зависят от наличия антител. Вместо выработки антител клеточные антигены или внутрисосудистые протеины активируют лимфоидные клетки, известные как тимусзави- симые лимфоциты. Активированные Т-клетки могут непосредственно убить чужеродные клетки или продуцировать особые вещества - лимфокины, которые организуют иммунный ответ. Лимфокины опосредуют возникновение воспаления на месте расположения чужеродного антигена. Они регулируют действия макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов, лимфоцитов и других клеток, убивающих чужеродные клетки и организмы. Развитие реакций идет медленно; они появляются только через 18-24 ч, достигают максимума к 48 ч и исчезают через 72-96 ч.
Примерами клеточно-опосредованных иммунных ответов могут служить кожная туберкулиновая проба, отторжение трансплантата, аллергия к сумаху укореняющемуся.
Отклонения клеточно-опосредованной иммунной функции вызывают недостаточность системы нормального иммунного надзора, вследствие чего больные подвергаются риску инфекции, вызванной условно-патогенными возбудителями. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) является манифестацией отклонений в системе клеточно-опосредованных иммунных реакций. Субпопуляции Т-лимфоцитов, известных как цитотоксические клетки-супрессоры, при инфицировании вирусом иммунодефицита человека (HTVL-III) претерпевают изменения, вследствие чего развивается СПИД. На фоне такого иммунодефицита могут проявляться инфекции, вызванные условно-патогенными возбудителями (например, Pneumocystis carinii) и лимфопролиферативные синдромы (например, саркома Капоши).

Иммунологическая реакция – это взаимодействие антигена с антителом, которое определяется специфическим взаимодействием активных центров антитела (паратопа) с эпитопами антигенов.

Общая классификация иммунологических реакций:

серологические реакции – реакции между антигенами (Aг) и антителами (Ig) in vitro ;

клеточные реакции с участием иммунокомпетентных клеток;

аллергические пробы – выявление гиперчувствительности.

2.7 Серологические реакции: цели постановки, общая классификация.

Цели постановки :

а) для идентификации антигена:

в патологическом материале (экспресс-диагностика);

в чистой культуре:

серологическая идентификация (определение вида);

серотипирование (определение серовара);

б) для выявления антител (Ig):

наличия (качественные реакции);

количества (нарастание титра – метод «парных сывороток»).

Общая классификация серологических реакций:

а) простые (2-х компонентные: Ag + Ig):

реакции агглютинации РА (с корпускулярным антигеном);

реакции преципитации РП (с растворимым антигеном);

б) сложные (3-х компонентные: Ag + Ig + C);

в) с использованием метки.

2.8 Варианты реакции агглютинации и преципитации

Реакция агглютинации :

а) с корпускулярным антигеном:

пластинчатая;

объемная;

непрамая:

латекс-агглютинация;

ко-агглютинация;

реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) = пассивной гемагглютинации (РПГА).

Реакция преципитации:

а) с растворимым антигеном:

объемная (например, реакция кольцепреципитации);

в геле (иммунодиффузия):

простая (по Манчини);

двойная или встречная (по Оухтерлони);

реакция нейтрализации токсина антитоксином (РН) (например реакция флокулляции);

другие варианты:

1. иммуноэлектрофорез;

   иммуноблотинг.

Сложные серологические реакции (3–х компонентные: Aг+Ig+C):

а) видимые:

иммобилизация;

иммунного прилипания;

лизиса (в том числе гемолиза);

б) невидимые:

реакция связывания комплемента (РСК).

2.10 Реакции с использованием метки:

РИФ – реакция иммунофлюоресценции;

ИФА – иммуноферментный анализ;

РИА – радиоиммунный анализ;

ИЭМ – иммунная электронная микроскопия.

Иммунный ответ. КИО. ГИО

4 Клеточный иммунный ответ

Иммунный ответ (ИО)– это комплекснаястадийная реакция иммунной системы организма, индуцированная антигеном и направленная на его элиминацию .

По механизмам эффекторного действия различают ИО:

– гуморальный (обеспечивается В- системой иммунитета),

– клеточный (обеспечивается Т-системой иммунитета).

В отличие от В-системы иммунитета , которая нейтрализует антиген с помощью антител,

–Т-система иммунитета уничтожает антигены, представленные на клетках, через прямое взаимодействие субпопуляции T-клеток – специфических цитотоксических T-клеток (=CD8 T-клеток = T-киллеров) с измененными собственными или чужеродными клетками;

–Т-клетки распознают не собственно антигенный пептид (эпитоп) , а его комплекс с молекулами МНС I или МНС II .

Реакции КИО лежат в основе:

реакции отторжения трансплантанта,

аллергической реакции замедленного типа,

противоопухолевого иммунитета,

Этапы КИО:

поглощение и процессинг АГ

В качестве антигенпрезентирующих (АПК) клеток в КИО участвуют дендритные клетки или макрофаги.

Процессинг сводится к:

– расщеплению исходной молекулы до уровня специфических пептидов,

– активации синтеза в АПК антигенов МНС I или II классов,

– образованию комплекса антигенный пептид + МНС I или II класса и к экспрессии его на мембране АПК.

презентация АГ:

– комплекс антигенный пептид + МНС I презентируется для опознания прецитотоксическим Т-лимфоцитам с фенотипом CD8+;

комплекс антигенный пептид + МНС II - Т-хелперам, имеющим фенотип CD4+.

– узнавание Т-клеточным рецептором (TCR) комплекса антигенный пептид + МНС I или II класса. При этом важную роль играют адгезивные молекулы CD28 на Т-лимфоцитах и CD80 (CD86) – на АПК, выполняющие функцию корецепторов;

активация Т-лимфоцитов – переход из стадии покоя в стадию G 1 клеточного цикла. Условие активации – передача сигнала от клеточной мембраны к ядру. В результате образуется ряд транскрипционных молекул, активирующих гены важнейших цитокинов. Синтезируются ИЛ2 и рецептора для него – ИЛ2R, гамма-интерферон (γИФН) и ИЛ4.

Пролиферация – размножение специфического по отношению к данному антигену клона Т-лимфоцитов (клональная экспансия ) под действие ИЛ2. Лишь размножившийся клон лимфоцитов способен выполнять функции по элиминации антигена.

Дифференцировка – процесс специализации функций клеток внутри специфического клона:

– под действием γИФН активируется процесс синтеза антигенпрезентирующими клетками ИЛ12, который воздействует на исходные специфические Т-хелперы нулевые (Th0) и тем самым способствует их дифференцировке в Тh1.

– Th1 продуцируют γИФН, ИЛ2 и факторы некроза опухоли альфа- и бета- , а также контролируют развитие клеточного иммунного ответа, и гиперчувствительности замедленного типа.

эффекторная фаза – уничтожение клетки-мишени. Происходит активация киллерной функции прецитотоксических лимфоцитов (специфических киллеров), натуральных киллеров, моноцитов, макрофагов и гранулоцитов. ПреЦТЛ дифференцируются в ЦТЛ, экспрессируя рецепторы к ИЛ2.

ЦТЛ убивают внутриклеточные бактерии и простейшие, инфицированные вирусами клетки, а также клетки опухоли и аллогенного трансплантата.

Каждый ЦТЛ способен лизировать несколько чужеродных клеток-мишеней.

Этот процесс осуществляется в три стадии:

распознавание и контакт с клетками-мишенями;

летальный удар – перфорины и цитолизины действуют на мембрану клетки-мишени и образуют в ней поры;

лизис клетки-мишени – через образовавшиеся под влиянием перфоринов и цитолизинов поры проникает вода, разрывающая клетки.

Схема клеточного иммунного ответа

Закономерности развития гуморального иммунного ответа на проникновение тимусзависимых и тимуснезависимых антигенов.

Протекание процесса презентации АГ лимфоциту зависит от типа антигена. Все АГ делятся на тимусзависимые и тимуснезависимые. Большинство антигенов тимусзависимые. Презентация тимуснезависимого антигена проходит по схеме: М––>Вл. Презентация тимусзависимого антигена проходит по схеме: М––>Тх2––> Вл.

Тимуснезависимый антигенов мало. Они являются сильными митогенами. Должны быть полимеризованного характера и иметь большое количество одинаковых эпитопов (например: липополисахариды клеточной Гр(-) микроорганизмов). На поверхности В-лимфоцитов очень большое число антигенраспознающих рецепторов одной специфичности. Эти рецепторы подвижные. Как только на них действует липополисахарид, происходит агрегация рецепторов, приводящая к концентрированию их в одном месте в виде «шапочки» – это первый сигнал к активации В-лимфоцитов. Второй сигнал В-лимфоциты получают от макрофага в виде медиатора, которым является ИЛ1. После этого происходит активация В-лимфоцита и трансформация его в бластные клетки; они увеличиваются в размере, 6-7 раз делятся и дифференцируются в плазматические клетки, синтезирующие иммуноглобулин малой специфичности IgМ.

Тимуснезависимый антиген индуцирует пролиферацию клона клеток с АГ-специфическими рецепторами. Особенностью ИО в данном случае заключается в следующем: 1) не происходит переключения синтеза IgМ на синтез иммуноглобулинов класса G и др. классов; 2) тормозится ИО, т.к. не образуются клетки памяти; 3) быстро возникает иммунологическая толерантность.

Тимусзависимые антигены вызывают ИО, включающий следующие стадии: 1) Презентация антигена Т-хелперу; 2) специфическое распознание Т-хелпером антигена на поверхности макрофага через антигенраспознающий рецептор. Распознание идет в комплексе с молекулами HLA–DR. На этом этапе, получив антигенную информацию от макрофага, Т-хелпер получает медиаторный сигнал от макрофага в виде ИЛ-1. Это активирует Т-хелпер. Активированный Т-хелпер выделяет различные лимфокины (ИЛ-2,ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, митогенный и бластогенный фактор), что способствует экспрессии на поверхности Т-лимфоцитов рецепторов для ИЛ-2 и ИЛ-4. Это продукты самого Т-хелпера, которые поддерживают его в активном состоянии. Кроме этого, эти продукты активируют В-лимфоциты вместе с ИЛ-1, который В-лимфоцит получает от макрофага.

Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum —сыворотка и logos — учение),т.е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни.

Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др,

При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т,е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих антимикробные антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

Реакция агглютинации: Реакция агглютинации (от лат. oggiutinatio — склеивание) — склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов. Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), «склеенных» антителами (рис. 7.37).

Реакцию агглютинации используют для: определения возбудителя, выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови.

1. Определение возбудителя, выделенного от больного

Ориентировочная реакция агглютинации нз стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок.

Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного.

К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного

2.Определение антител в сыворотке крови больного:

Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного. К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум.

— Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие Q-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.

— Агглютинация с Н-диогностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации выявляют антитела сыворотки крови больного с помощью антигенного зритроциторного диагностиками, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами

Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови,что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки ввиде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки». РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикам — эритроциты, на которых адсорбированы антитела, Например, можно обнаружить ботупиничес- кий токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА).

Реакция Кумбса Реакция агглютинации для определения антирезусных антител (непрямая реакция Кумбса). У некоторых больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалентными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами (Rh+), но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют анти глобул и новую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов

С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов, например, гемолитическую болезнь новорожденных: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери.

Можно также выявлять неполные антитела против антигенных микробов.

Реакция торможения гемагглютинации Гемагглютинины вирусов склеивают эритроциты. Это свойство используют в реакции гемагглютинации для индикации и титрования вирусов, что необходимо для последующей постановки РТГА. Реакция торможения гемагглютинации основана на блокаде, подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов антитепами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

Реакция преципитации Реакция преципитации (от лат. praecipito — осаждать) — это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

Реакция кольцепреципитации , Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов об- эазуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).

Иммуноэлектрофорез — сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку геля параллельно зонам электрофорезавносят иммунную сыворотку. Антитела иммунной сыворотки диффундируют в гель и образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации.

Реакция флоккуляции (по Рамону) {от лат, floccus — хлопья шерсти} — появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин—антитоксин или анатоксин—антитоксин, Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Штаммы возбудителя дифтерии — С, cliphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенны- МИ, Образование экзотоксина зависит от наличия в бактерияхпрофага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность — продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре.

Реакция нейтрализации Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорято нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.

Реакция связывания комплемента Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным

РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная). РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана).

Реакция иммунофлюоресценции Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, или метод Кунса). Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс- диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лу- чах люминесцентного микроскопа (рис. 7.61). Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген—антитело с помощью а нти глобул и новой (против антител) сыворотки, меченной флюорохромом. Для зтого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок а нти глобул и новой {антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

IT. При определении антигена в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов (рис. 7.65).

Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИЧ>А или РИА). Иммуноблоттинг ислользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг — от англ. blot — пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА, Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов*. На эти полоски наносят сыворотку больного B). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом C). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген 4- антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата D), изменяющего окраску под действием фермента.

Полимеразная цепная реакция: основана на амплификации, т.е. увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют («расплетают» при нагревании) и достраивают (при охлаждении) к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити. В результате из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно повторяется при заданных температурных режимах. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам праймеров (затравки из коротких од- нонитевых ДНК, комплементарных З"-концам ДНК искомого гена), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

1. Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

Рис. 2. РА на стекле.

На предметное стекло наносят каплями:

1 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;
3 -ья капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий . Перемешивают.

Примечание : положительный результат - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа.

2. Учет результатов РНГА , поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками . Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Рис. 3. Постановка и результат РНГА.

Учет зонтик пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

Реакция преципитации – это формированиеи осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

3. Постановка и учет реакции кольцепреципитации для определения видовой принадлежности кровяного пятна.

Постановка . В узкую пробирку №1 диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой против белков крови человека в количестве 0,3-0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена (экстракт кровяного пятна ). В пробирку №2 приливают преципитационную сыворотку против белков барана, в пробирку №3 - физиологический раствор (контроль) и добавляют также, как в первую пробирку антиген. Пробирки осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.
Учет . Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через 20-24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

Рис. 4. Реакция кольцепреципитации.

4. Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции преципитации в агаре .

Эта издавна используемая реакция преципитации, предложенная для определения токсичности коринебактерий дифтерии, ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри. Вдоль ее посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой . После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры. В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная, должна быть заведомо токсигенной. Посевы помещают в термостат.

Учет реакций проводят через 24-48-72 ч. Если культура токсигенная, на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата, совпадающие с линиями преципитата контрольной культуры. Они имеют вид «стрел-усиков », которые хорошо видны в проходящем свете.

Рис. 5. Реакция преципитации в агаре.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

5. Постановка непрямой реакции гемагглютинации (РНГА ) выявления титра специфических антител у больного.

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика).
Постановка . В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.
Учет . В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик ), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Рис. 6. Результат РНГА. Титр антител - 1:100.

6. Постановка развернутой реакции агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр ). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий, с которыми безопасно работать.
Ставят реакцию следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками:++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).
За титр сыворотки принимают последнее ее разведение , в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

Рис. 7. Развернутая реакция агглютинации.

В XVIII в. многие люди, будучи уверены, что когда-нибудь в жизни они все равно зара-зятся оспой, намеренно подвергали себя возможности заражения, для того чтобы переболеть этой болезнью в более благоприятных условиях и в дальнейшем не опасаться ее. Даже и теперь некоторые родители из тех же соображений не предохраняют своих детей от заражения детскими болезнями, зная, что некоторыми болезнями люди болеют лишь один раз в жизни. Этот тип устойчивости называется приобретенным иммунитетом. Но человек, невосприимчивый к оспе в результате перенесения этой болезни, обладает такой же восприимчивостью к кори или к любой другой болезни, как и тот, кто никогда не болел оспой; поэтому мы говорим, что иммунитет специфичен.

Активно приобретенный иммунитет обусловлен образованием в организме специфических белков, так называемых антител, которые выделяются в кровь и в тканевые жидкости после проникновения в организм какого-либо чужеродного белка, называемого антигеном. Антиген и антитело реагируют друг с другом, и это предохраняет организм от повреждения. Если, например, впрыснуть кролику яичный альбумин (белковое вещество), то клетки животного отвечают выработкой антител, специфичных по отношению к этому альбумину. Кроме того, организм способен вырабатывать особый род антител, называемый антитоксином, в ответ на присутствие токсина (обычно белка), выделяемого бактерией. После того как образовалось достаточное количество антитоксина, данный токсин уже не может причинить вреда организму.

Уже несколько десятков лет назад было известно, что антитела, образующиеся в ответ на введение данного антигена, не всегда однородны - они могут различаться по своей специфичности, по степени активности в отношении реакции с антигеном и по физико-химическим свойствам, (величине и форме молекулы, ее суммарному заряду и последовательности аминокислот).

Антитела, циркулирующие в крови, связаны с определенной фракцией плазмы - гамма-глобулинами. Гамма-глобулины - белки, очень сходные по своим физическим и химическим свойствам, но различающиеся по специфичности в отношении антигенов. Различия между разными антителами совершенно неуловимы; они даже еще более тонкие, чем различия между разными ферментами. По-видимому, лишь небольшая часть белковой молекулы (имеющая молекулярный вес порядка 160 000) иммуноло-гически активна. Различия между разными

антителами, по-видимому, сводятся к незначительным различиям в форме молекулы бедка, в расположении составляющих ее атомов, обеспечивающем комплементарность геометрических конфигураций антигена и антитела, которые должны подходить друг к другу, как ключ и замок.

Лимфатические ткани обычно синтезируют антитела только к «чужеродным» белкам, т. е. к белкам, которые при нормальных условиях не содержатся в организме. Но иногда некоторые нормальные компоненты тела могут обладать антигенным действием и вызывать обра-

зование антител; в результате возникающей при этом реакции антиген-антитело человек может заболеть.

После инъекции антигена наступает латентный период, продолжающийся примерно неделю, а затем в крови появляются антитела. Титр антител медленно повышается, достигает невысокого пика (первичная реакция) и вновь снижается. Вторичная инъекция антигена через несколько дней, недель или даже месяцев вызывает быстрое образование антител после более короткого латентного периода (вторичная реакция). Титр антител достигает более высокого уровня и снижается медленнее. Последующие инъекции антигена вызывают дополнительные вторичные реакции, до тех пор пока не будет достигнут максимальный титр. Со временем этот титр обычно снижается, и периодическая peiиммунизация помогает поддерживать иммунитет на удовлетворительном уровне. У предварительно иммунизированного человека вторичную реакцию можно также вызвать, заразив его естественным инфекционным агентом; антитела при этом обычно образуются достаточно быстро и предотвращают появление симптомов заболевания.

Механизм образования специфических антител под действием антигена неизвестен. Известно только, что антитела синтезируются заново из аминокислот, а не просто образуются путем изменения пространственной конформа-ции предсуществующей полипептидной цепи. Синтез этих специфических белков происходит, вероятно, так же, как и обычный синтез белков в рибосомах клетки, т. е. под контролем рибонуклеиновокислотных матриц (см. разд. 342). Антиген, по-видимому, входит в плаз-моциты и другие «иммунологически компетент-ные» клетки и вызывает образование специфической нуклеиновой кислоты-матрицы, которая в свою очередь определяет образование специфического антитела. Возможно, что информацию, необходимую для синтеза специфических антител, доставляет сам антиген или же она постоянно присутствует в клетке, будучи заключена в генах, но может быть использована только в присутствии специфического антигена. Высказывалось также мнение, что проникновение в клетку антигена ведет к проявлению генетически обусловленной способности к синтезу специфического антитела, находившейся до того в скрытом состоянии. Эта последняя теория дает наилучшее объяснение экспериментальным фактам, известным в настоящее время, и больше соответствует общей теории регуляции синтеза белков. Когда плаз-моциты, образующие специфическое антитело, делятся, обе дочерние клетки сохраняют способность вырабатывать такие же антитела, и эта информация передается на протяжении многих поколений клеток.

Антитела реагируют с антигеном одним или несколькими различными способами. Они могут соединяться с токсином, нейтрализуя его ядовитые свойства; они могут растворять клетки бактерий; наконец, они могут сенсибилизировать бактерии - делать их более уязвимыми для лейкоцитов. Некоторые антитела агглютинируют микробы тем самым препятствуя их распространению и еще вернее обеспечивая их задержку в лимфатических узлах.

Антитела метят, присоединяя к ним флуоресцирующий краситель, после чего их можно выявлять в специфических участках тканей с помощью микроскопа. Этот метод, разработанный в 1941 г. Кунсом, позволил проводить разнообразные исследования с определением локализации в клетке специфических реакций между антигеном и антителом; он используется также в диагностике инфекционных болезней.

Другой способ приобретения иммунитета состоит в прививке при помощи вакцины. Вакцина - это специально производимый в больших количествах антиген, характерный для определенной болезни, достаточно сильный, чтобы стимулировать образование антител в организме, но не настолько сильный, чтобы вызвать самую болезнь. Токсичность антигена понижают различными способами. Некоторые вакцины содержат лишь небольшое количество токсина. Другие представляют собой комбинацию токсина с антитоксином: в то время как

антиген заставляет организм вырабатывать больше антител, антитела самой вакцины защищают клетки от повреждения. Некоторые токсины подвергают тепловой или химической обработке, уничтожающей их вредные свойства, но сохраняющей их способность стимулировать образование антител; такого рода вакцина называется анатоксином. Еще один метод состоит в ослаблении культур бактерий путем длительного выращивания их в пробирках, где они в конце концов утрачивают часть своей токсичности. Антирабическую вакцину (вакцина против бешенства) ослабляют высушиванием, другие вакцины - последовательной прививкой их ряду лабораторных животных. Брюшнотифозную вакцину можно приготовить из убитых бактерий брюшного тифа.

Метод вакцинации был открыт в конце XVIII в. английским врачом Э. Дженнером, который заметил, что работники, имевшие дело с коровами, больными коровьей оспой, никогда не заболевали настоящей оспой. Когда он попробовал втереть немного жидкости, взятой из оспенных пузырьков на коровьем вымени, в царапину на коже человека, то возникло легкое заболевание с появлением одной локализованной оспины в месте втирания. Вакцинированные таким способом люди никогда не заболевали оспой. Коровью оспу и настоящую оспу вызывают два различных, но близкородственных вируса; прививка вируса коровьей оспы вызывает образование антител, способных реагировать также и с близкородственным ему вирусом оспы человека. Теоретически представляется возможным создавать путем прививок иммунитет против всех болезней, но для многих важных заболеваний, в том числе для туберкулеза, гриппа и сифилиса, способы вакцинации еще не разработаны.

Часто случается, что организм не способен достаточно быстро вырабатывать антитела для борьбы с антигенами микроба. В таких случаях производят инъекции антител какого-нибудь животного (обычно лошади), чтобы снабдить ими организм до того времени, когда он сам сможет вырабатывать их в достаточном для защиты количестве. Впрыскивание препарата антител (называемого сывороткой)- это единственный способ получения пассивного иммунитета; хотя такой иммунитет оказывает немедленное действие, он полностью исчезает спустя несколько недель.

Для приготовления сыворотки бактерий выращивают в пробирках до тех пор, пока не образуется большое количество токсина. Затем

этот токсин впрыскивают в возрастающих дозах лошади, и организм животного постепенно вырабатывает огромное количество антитоксина, который накапливается в крови. После этого у лошади время от времени берут кровь, удаляют из нее эритроциты и концентрируют антитоксин.

Естественный иммунитет. У всех животных и растений невосприимчивость к определенным болезням является наследственным свойством, и ее не приходится приобретать. Есть данные, указывающие на то, что различные расы человека наследственно различаются между собой по устойчивости к таким болезням, как туберкулез, дифтерия и грипп. Наследственная невосприимчивость к болезням, называемая естественным иммунитетом, передается из поколения в поколение.

Один из типов естественного иммунитета - это невосприимчивость, выработавшаяся в популяции, которая соприкасалась с возбудителем определенной болезни на протяжении многих поколений. Многие болезни (например, корь), в наши дни сравнительно легко протекающие

у европейцев, чрезвычайно тяжело протекали у американских индейцев и у жителей островов южной части Тихого океана, когда они впервые распространились среди этих народов. Сифилис тоже в настоящее время представляет собой гораздо более легкое заболевание, чем во времена первого появления его в Европе, когда он нередко в первый же месяц приводил к смерти. Многие тропические болезни, например малярия и сонная болезнь, у иностранцев протекают тяжелее, чем у местного населения. Другие болезни, первоначально весьма распространенные, со временем стали редкими: например, проказа чрезвычайно часто встречалась в библейские времена.

Эти изменения к лучшему обычно истолковывают как результат постепенного «естественного отбора»: люди, перенесшие в далекие времена данную болезнь, передавали свою «стойкость» своим потомкам и так далее. Возможно также, что в некоторых случаях адаптировались и сами микроорганизмы, что сопровождалось понижением их вирулентности.

Нормальный вирус или вирус, убитый слабым нагреванием или действием ультрафиолетового света, может препятствовать росту других вирусов в организме хозяина. Этим можно было бы объяснить малое распространение таких заболеваний, как полиомиелит, в областях, где эндемичны другие кишечные вирусы. Присутствие этих вирусов препятствует росту вируса полиомиелита; однако их действие состоит не в том, что они вызывают образование антител, а в том, что они побуждают клетки хозяина вырабатывать вещество, называемое интерфероном. Это вещество удалось выделить; оно представляет собой белок с молекулярным весом около 63 000.

Это недавно открытое явление служит, возможно, другим важным фактором защиты организма от болезней. Антитела имеют особенно важное значение в создании иммунитета к повторному заражению данным возбудителем; интерферон же, вероятно, играет важную роль в защите при первом заражении вирусом.

Исследователи доказали, что интерферон образуется в ответ на вирусную инфекцию; концентрация его достигает максимума на 3- 5-й день после заражения, тогда как антитела к инфекционному агенту появляются гораздо позднее - не ранее 8-го дня.

Интерферон действует не прямо на вирус, а на клетку-хозяина. Вирус проникает в клетки, обработанные интерфероном, но не способен размножаться в них. Интерферон, по-видимому, уменьшает количество АТФ, которое может быть использовано для размножения вируса, возможно путем разобщения процессов фосфо-рилирования и окисления (см. разд. 57). Имеющиеся данные позволяют предполагать, что существует интерферон только одного типа и что он эффективен против самых различных вирусов. Ссылки по теме